全光纤传输光度测量系统独特的功能

与传统的大脑成像技术相比，光纤光度法越来越受欢迎，它可以更好地掌握大脑的内部运作。随着方法的不断改进，这是一个新技术的开始。

图 1. 多通道光纤光度测量系统（photometry system）的构建。488nm 激光器的光束通过物镜同时耦合到一系列多模光纤中。然后发射的荧光由同一组光纤收集并由 sCMOS 相机 (a) 检测。双通道模式 (b) 和四通道模式 (c) 的 sCMOS 相机上的光纤端面。

对大脑复杂性的全面、完整的理解仍然难以捉摸。揭开它的奥秘是了解神经系统疾病的关键——从阿尔茨海默氏症（Alzheimer’s）和痴呆症（dementia）到癫痫（epilepsy）和多发性硬化症（multiple sclerosis）——以及更有效地治疗甚至治愈它们的能力。

长期依赖的非侵入性成像技术（non-invasive imagingtechniques），如 MRI 和 CT 扫描提供了对大脑内部的观察条件，但使用光纤的方法显示出更为良好的效果，尤其是光纤光度法（fiber photometry）。

光纤光度法是一种用于研究神经回路的光学成像技术，最初由慕尼黑路德维希马克西米利安大学（Ludwig Maximilian Universityof Munich）的一个团队于 2005 年开发，用于记录新生小鼠静息时的皮质（大脑外层the outer layer of the cerebrum）钙离子波(Ca2+) 。它涉及将光纤植入大脑，以观察和记录大脑不同区域内特定类型细胞的神经元群体水平（population-level）的 Ca2+ 活动。在大脑中，钙活动是控制突触运动和记忆形成等活动的核心。

与基因编码（genetically encoded）的钙指示剂（calcium indicators）结合使用，纤维光度法可以实时监测神经活动。

“纤维光度法提供了一种独特的功能，可以轻松稳定地记录自由活动动物中具有细胞类型特异性的种群活动，” 华中科技大学的Ruonan Fan 博士说。她在华中武汉光电子国家实验室助理主任、布里顿机会生物医学光子学中心首席研究员傅玲领导的实验室工作。

不断增长的优势

虽然低时间和空间分辨率是一个显着的挑战，但光度法仍然是优于其他钙成像技术（如单光子或双光子显微镜）的首选方法。光纤更容易植入，重量也更轻，允许受试者自由移动和执行自然行为，这也是该技术的关键。光纤光度法也更能抵抗电磁干扰，更有效地收集数据，并且迄今为止已被证明对于长期神经监测更稳定。

“它已成为神经科学中一种广泛使用的光学方法，”范博士提到，并引用了 Fu 教授团队在 2015 年开发的可扩展多通道光纤光度测量系统，该系统可以同时监测动物甚至不同动物的多个大脑区域的神经活动。

Fu 实验室领导的另一项研究涉及在 2019 年开发特定于轴突末端的多通道光纤光度计。研究小组在研究中解释说，轴突主要通过其末端的突触将信息从一个神经元传输到另一个神经元，并且“从自由移动动物的轴突末端记录是了解动物行为过程中信息处理的重要步骤。”

现在，由 Fu 团队领导的正在进行的研究（今年 5 月首次发表）在传统技术的基础上提供了更多优势。

“我们开发了一种兼容且灵活的全光纤传输光度测量系统，”范说。“我们可以同时实现光遗传学操作和神经元活动的多色记录以及自由移动（neuronal activities）动物的神经递质释放（neurotransmitter release）。”

该团队一直在研究在动物行为期间以细胞类型特异性和精确的时空分辨率来操纵和实时监测神经元活动。“这些是探索体内神经回路的功能连接、信息传递和生理功能的基础技术，”范说。

新的全光纤传输光度测量系统基于多分支光纤束（图 1）。它允许在自由移动的动物中同时进行光遗传学操作和多色记录神经元 Ca2+（或神经递质信号）。

“这是对当前光纤光度测量系统的有效补充，”范说。

新系统实现了对可见光谱（visible spectrum）的全覆盖，用于多色激发和光遗传学（optogenetic）操作，以及激发和发射光的全光纤传输。范说，这是通过结合非波长选择性四分支纤维束专门完成的，该纤维束可以实现多色记录（multicolor recording），同时还支持精确的光遗传学刺激（图 2）。该束与光电倍增管 (PMT) 相结合，以取代传统的成像结构。还使用了定制设计的锁定放大器，以准确分离 PMT 检测到的具有不同波长的两个荧光信号，并有效抑制光遗传学刺激引起的伪影（artifacts）和通道串扰(channel crosstalk)。

图 2. 定制设计的四分支光纤束和多功能光纤光度测量系统。四分支纤维束（a）包括单纤维分支（i~iii）、集合分支（iv）和公共分支（v）。四分支光纤束 (b) 普通分支 (v) 示意图。公共分支 v (500 μm) 总共由 85 根六边形分布式光纤 (Φ50 μm/0.54 NA) 组成。束中心的三个较亮的光纤对应于三个单光纤分支 (i~iii)，用于耦合到三个不同的激发光。四分支光纤束构建的多功能光纤测光系统示意图。将三个不同波长的光源耦合到多模光纤中，并通过三个单纤分支 i~iii (c) 连接到鼠标。多功能光纤测光系统的锁定放大器示意图（d）。这两种激发光由具有不同频率（450 nm，211 Hz；561 nm，531 Hz）的正弦信号调制。

“我们进行了一系列实验，表明该系统具有出色的透光性能。它能够有效地激发和收集荧光信号，收集效率比传统系统提高 20% 到 30%。”范说。

研究小组没有发现实质性的通道串扰，并成功记录了伏隔核 (NAc) 中的神经元 Ca2+ 和神经递质动态信号——一种主要由中等多刺神经元组成的结构，其特点是多巴胺受体（dopamine receptors）的相对表达——同时在自由移动的小鼠身上对同一部位的多巴胺能末端进行精确的光遗传学操作。研究人员还能够在记录时将刺激伪影（由于它们是非生理性的而导致噪声干扰的短时间、高振幅的神经尖峰）抑制到基础噪声水平（basal noise level）（图 3）。

图 3. 自由移动小鼠 NAcLat（伏隔核外侧壳）中神经元活动的同时双色记录和光遗传学操作。 (a) 神经元活动手术同步双色记录和光遗传学操作示意图。 (b) 组织学证实 NAcLat 中 GFP (绿色) 标记的神经元和 ChrimsonR (红色) 标记的多巴胺能神经元末端表达。脑切片在前囟前 1.1 毫米处。 (c) 在该系统中同时进行光遗传学操作和实时双色记录时不存在刺激伪影。红色条表示刺激时间。 (d) 在自由移动的小鼠的 NAcLat 中同时记录的 DA 和神经元 Ca2+ 痕迹的示例。 (e) 响应阶段性光遗传学刺激的平均 DA 信号和神经元 Ca2+ 信号瞬变（10 次试验）。红色条表示刺激时间。橙色段表示从基线统计显着增加。 (f) 响应强直光遗传学的平均 DA 信号和神经元 Ca2+ 信号瞬变。红色条表示刺激时间。

“随着它的进步，纤维光度法在神经科学家中越来越受欢迎，作为记录基因定义的神经元群体的便捷工具，”范说。“而后续的改进主要集中在不同的应用需求上。”

早期用于光遗传学操纵或记录神经元活动的光纤测光技术和系统通常是分开的并独立工作，它们只能在单个波长下进行操纵和单通道记录。另一个挑战是，由于光敏蛋白（spectrum of photosensitiveproteins）的激发光谱与基因编码的钙指示剂的发射光谱之间的重叠，在多色记录和操作过程中会出现刺激伪影（stimulation artifacts）。

“为了同时实现光遗传学操作和双色记录，需要涉及更多具有光谱间距的波长范围荧光蛋白，”范说。“因此，光学系统需要完全覆盖可见光谱。”

但范补充说，这是目前可用的光纤光度测量系统的一个问题，因为它们使用经典的落射荧光成像架构（classical epifluorescenceimaging architecture）仅覆盖 405 到 600 nm 左右的光谱，该架构由一个物镜和两个或三个二向色镜组成。 “在这种情况下，”她说，“需要更多的分色镜将多波长光束耦合到一根光纤中，这使得系统扩展光谱更加复杂。”

新的全光纤传输光度测量系统可用于“进一步观察不同类型神经元的活动，同时进行光遗传学操作和多色记录，以监测光遗传学干预神经回路引起的反馈效应，”范说。 “这现在被认为是神经回路和神经系统疾病因果研究的‘梦想方法’。”