用于超高通量筛选的荧光偶联液滴微流控策略研究进展

近十年来，荧光激活液滴分选技术（FADS）快速发展，已成为一种强大的超高通量筛选工具，广泛应用于酶、代谢产物和抗体筛选。

高灵敏度荧光偶联策略（FCSs）是FADS应用拓展的关键技术，可将酶活性、代谢产物浓度、抗体亲和力等性质与荧光信号进行偶联，实现目标物质定量检测，是FADS应用发展关键环节之一。

截止目前，一系列FCSs已经被开发，极大地扩展了FADS的应用（图1）。  



图1 FADS系统工作流程图

据麦姆斯咨询报道，近日，中国科学院苏州生物医学工程技术研究所医药酶工程研究中心马富强研究员团队在国际TOP期刊Biotechnology Advances上发表了题为“Fluorescence coupling strategies in fluorescence-activated droplet sorting (FADS) for ultrahigh-throughput screening of enzymes, metabolites, and antibodies”的综述论文。

该综述系统性回顾了十多年来不同分析物质（酶、代谢产物、抗体）荧光偶联液滴微流控研究的最新进展，并根据荧光偶联策略原理，将其分为四大类，包括荧光底物分析策略、酶联荧光分析策略、基于生物传感器的荧光偶联策略、基于抗体亲和力的荧光偶联策略。作者分别介绍了四类FADS的原理，并将各类策略液滴微流控研究进展进行了分析和总结。

荧光底物分析策略是酶筛选中最常用的荧光偶联方法之一。通过将荧光团与特定的官能团共价结合，以阻止其产生荧光信号。当目标酶催化荧光底物释放官能团，生成的荧光团产生荧光信号，其信号强度应与酶活性成线性关系，从而实现定量检测。

在过去十年中，已有多种荧光底物被设计、开发并应用于类酶活性检测中，包括水解酶、氧化还原酶、和裂解酶等（表1）。与此同时，荧光底物策略可用于宏基因组文库筛选或者难以培养的细菌群体中鉴定新的酶、新进化的催化酶。

表1 荧光底物策略在酶筛选中应用案例

FADS技术可以从大型突变库或难以培养的混合环境样品中筛选出所需的酶或细胞，但这些筛选所针对的大多数自然酶或代谢产物都是非荧光性的，不适合FADS系统。酶联荧光分析策略成为FADS应用另一关键技术，可将非荧光代谢产物的浓度或酶活力转化为荧光信号，实现荧光定量检测。

该综述对一系列的酶，如氧化酶、还原酶以及转移酶等，偶联相应底物特异性氧化酶，实现酶活力或代谢产物浓度分析和检测（表2）。

表2 酶联荧光策略在酶及代谢产物生产菌株筛选中的应用案例

生物传感器是基于目标分析物与检测信号成线性关系，通过信号强度进行分析、检测、定量的一类装置。荧光生物传感器是一种基于荧光分子产生信号的生物传感器，可设计多种识别元件，包括适配体、抗体、酶等。其中，适配体由RNA或DNA寡核苷酸构成，可特异性地结合目标分子，是生物传感器理想的识别元件。

将荧光分子纳入设计中，在荧光强度发生变化时可以监测目标分子与识别元件的结合，实现目标分子的实时检测和定量分析。这些生物传感器在多种场合中均有应用，包括体外试验和体内成像。基于此，该综述主要介绍了基于转录因子（TF）的荧光生物传感器（即基于抑制型-或激活荧光生物传感器）、基于RNA的荧光生物传感器以及基于FRET的荧光生物传感器，有效地将目标分析物浓度及性质转化为FADS超高通量筛选中的荧光信号。

表3 基于生物传感器荧光偶联策略在酶及代谢产物生产菌株筛选中的应用案例

抗体广泛用于研究和临床诊断，并用于治疗各种疾病。近年来，治疗性单克隆抗体数量在市场上显著增加。2021年全球单克隆抗体市场规模为1144.3亿美元，预计到2025年将增长至1795.6亿美元，年增长率（CAGR）估计为2021年至2025年11.9%。2022年全球销售最高的药物中有几种是抗体药物，包括Humira、Keytruda、Stelara和Opdivo。这凸显了抗体作为治疗感染、自身免疫和肿瘤性疾病的强效治疗剂的重要性。单克隆抗体可以通过噬菌体展示和相关技术高效筛选结合。

然而，由于常规杂交瘤筛选中只能容纳几千个克隆体，成本高、通量低。FADS在抗体筛选应用中优势突出，皮升或纳升级别的反应体系降低了成本并增加了通量，使得抗体分泌的定量、高灵敏度、实时动力学测量成为可能。本综述中，基于抗体亲和力作用，分别介绍了荧光聚集分析技术、酶活性抑制分析技术、亲和力响应报告细胞分析技术在功能性抗体筛选中的应用及拓展。

图2 基于抗体亲和力荧光偶联策略在抗体筛选中的应用案例示意图

综上所述，作者综述了不同类型荧光偶联策略及其应用发展，为液滴微流控系统在酶、代谢产物及抗体筛选应用拓展提供了重要的基础理论依据。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、中国科学院青年创新促进会会员资助计划等资助。

审核编辑：刘清