用于结直肠癌早期诊断的的外泌体检测平台

外泌体因其具有丰富的生物信息和高稳定性，被认为是结直肠癌（colorectal cancer，CRC）诊断的新型生物标志物。然而，对于具有特异性表面受体的外泌体的准确检测限制了其临床应用。

近期，山东大学齐鲁医学院杜鲁涛教授课题组在Small期刊上发表了题为“Construction of Exosome SORL1 Detection Platform Based on 3D Porous Microfluidic Chip and its Application in Early Diagnosis of Colorectal Cancer”的文章，构建了3D多孔海绵微流控芯片上的外泌体富集平台，该芯片的外泌体捕获效率约为90%。此外，研究人员通过深度质谱分析后进行多级表达筛选，揭示了CRC特异性外泌体膜蛋白（SORL1），并进一步设计了一种基于特定量子点标记的SORL1检测方法，通过对64张荧光图像进行特征提取，建立了集成分类系统。使用该系统的曲线下面积（AUC）为0.99，明显高于使用传统生物标志物。上述系统在处理早期、进展期和CEA阴性结直肠癌患者时表现出类似的诊断性能。

为克服近表面流体动力学阻力，提高表面体积比，并增强微通道内的传质，研究人员设计并构建了新型多孔海绵芯片。该平台由简单制备而成的聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚体、固化剂、研磨NaCl微粒生成硬模板。通过调节模板与PDMS预聚体的混合比例和NaCl粉末的直径，从而改变微流控芯片中PDMS海绵的多孔结构（图1A）。针对CRC患者，通过质谱蛋白组学分析筛选到一个新的外泌体表面蛋白SORL1，并通过蛋白质印迹法（Western blotting，WB）和流式细胞术检测进行验证。接着，利用构建的多孔海绵芯片和硅量子点（Si-QD）共轭捕获抗体检测CRC患者血清中外泌体SORL1的表达（图1B）。最后，将获得的荧光图像使用基于AI的集成分类系统进行分析和量化，该系统可以高效准确地区分CRC患者和非CRC人群（图1C）。

图1 3D多孔海绵芯片的构建及外泌体的分析

为了实现对CRC来源外泌体的高灵敏度检测，研究人员首先使用球磨机研磨NaCl颗粒形成均匀的粉末。如图2A所示，未处理的NaCl平均粒径在粉碎后由176 µm ± 35 µm减小到3.35 µm ± 0.87 µm，说明粉碎方法可以有效降低NaCl平均粒径。多孔海绵芯片的实物图和渲染图如图2B所示。芯片（左上面板）中心的白色区域是多孔PDMS海绵结构，在相邻的多孔结构之间具有凹槽，以破坏层流。多孔PDMS结构的表面和断面扫描电子显微镜（SEM）图像也显示了具有相互连通的孔洞的多孔形貌。该研究利用PDMS可以非特异性地大量吸附蛋白质的原理，将抗体高效地固定在芯片内部的多孔PDMS结构上。使用CD9抗体进行固定以捕获外泌体，并选择两种抗体固定方法：分别在37℃孵育2 h和4℃孵育过夜。为了探究最佳的抗体固定方法，使用荧光显微镜对芯片进行荧光成像。以FITC二抗的荧光强度用来评价一抗固定效果。对于BSA和PBS孵育的两组芯片，非特异性荧光吸附较弱，两组芯片的荧光强度均远低于CD9抗体孵育组（图2C）。37℃孵育2 h后的抗体固定量是4℃孵育过夜的4.797倍，表明37°C孵育2 h是抗体固定的最佳条件。

随后，研究人员通过超速离心法从SW1116细胞的培养上清中获得纯化的结肠癌外泌体。采用透射电子显微镜（TEM）、Western blotting和纳米颗粒跟踪分析（NTA）3种应用最广泛的外泌体分析方法对分离的外泌体进行性质表征。图2D显示了标准的外泌体形态，包括圆形或椭球形。采用NTA分析外泌体浓度和平均直径。粒径为103.1 nm，峰浓度为7.7 × 10⁶，与文献报道一致（图2E）。利用Western blotting鉴定出癌细胞和外泌体膜靶蛋白CD9、CD63和TSG101（图2F）。随着样品的持续进样，芯片的实时荧光捕获效率逐渐降低。20 µL时荧光强度（ΔFL）最高为97.45% ± 2.29%，100 µL时ΔFL最低为74.45% ± 8.8%，ΔFL的平均荧光效率为85.25% ± 5.51%（图2G）。多孔海绵芯片的NTA捕获效率为80.12% ± 3.45%，而超速离心仅为15.5% ± 1.70%（图2H）。荧光图像进一步揭示了外泌体具有较高的捕获效率（图2I）。NTA和荧光分析得到的结果一致，证明了多孔海绵芯片分离和捕获外泌体的高效性。

图2 外泌体和3D多孔海绵芯片的表征   接着，研究人员初步选取8例健康人（HCs）和8例CRC患者的血清样本，对收集到的血清外泌体进行无标记蛋白质组学分析。与HCs相比，CRC患者中共鉴定出367个差异表达蛋白，其中上调蛋白136个，下调蛋白231个，包括FTH1、RPS8、CFH、PIGR、PSMA3和CCT8（图3A）。在CRC和正常样本中分别有25个蛋白和62个蛋白特异性表达。

为了验证筛选出的分子是否位于外泌体膜表面，研究人员使用SW620细胞来源的外泌体进行流式检测。结果显示，与对照组相比，CRC样本中SORL1和PSMA3的荧光强度较高，而CCT8、PIGR和CAT表达在基础水平，表明SORL1和PSMA3定位于外泌体膜表面（图3B）。接下来，通过Western blotting分析测定细胞上清和血清样本外泌体中SORL1和PSMA3蛋白的表达水平。结果显示，在CRC细胞培养上清中可以稳定检测到SORL1和PSMA3（图3C）。此外，与HCs相比，SORL1在CRC患者血清中表现出更高的表达，而PSMA3的表达无统计学意义（图3D）。通过对27例CRC患者和27例HCs血清中外泌体SORL1的定量检测，研究人员证实了CRC患者血清中SORL1的水平显著高于HCs，表明外泌体SORL1在区分结直肠癌患者和非结直肠癌人群中的潜在诊断价值（图3E）。

图3 无标记定量蛋白质组学对外泌体蛋白的分析

为了利用3D微流控芯片有效定量SORL1的表达，研究人员制备了Si-QD偶联的SORL1抗体（Si-QD-SORL1）。TEM结果表明Si-QD和SORL1抗体融合，成功合成了Si-QD-SORL1复合物（图4A）。UV-vis光谱扫描结果证明Si-QD在357 nm处有明显的吸收峰，加入SORL1抗体形成Si-QD-SORL1复合物后，吸收峰明显减弱（图4B）。将3D多孔芯片与Si-QD-SORL1结合后，在室温下放置10 min、30 min、50 min、70 min和90 min后评估荧光强度稳定性。结果表明，在所考察的时间范围内，荧光强度无明显变化，表明Si-QD-SORL1复合物具有较高的稳定性（图4C）。为了确认注入芯片的样品荧光强度是饱和且稳定的，研究人员测试了多孔芯片组合的最佳Si-QD-SORL1的体积和浓度。根据图4D所示，芯片从左到右有3个捕获区域，捕获区域的荧光分布均匀稳定，能够准确反映外泌体SORL1的整体表达情况（图4E）。此外，研究人员对外泌体进行PKH67-green染色，观察到Si-QD-SORL1（红色信号）与CD9结合的外泌体共定位（图4F）。这证实了荧光信号是通过两步免疫反应检测通道中的量子点产生的。

图4 Si-QD-SORL1及外泌体检测系统的表征

为了更好地理解和准确判读荧光成像结果，研究人员通过激光扫描共聚焦显微镜（CLSM）高分辨率荧光筛选，开发、训练和优化了图像检测模块。首先，为了提高集成系统的解译效果，系统将影像划分为64个图斑，并基于亮度、方差和均值3个特征获取信息（图5A）。接下来，研究人员招募了一个独立、匹配和随机分配的人群队列，包括106名CRC和100名HC，并将其分为训练和测试阶段。在训练阶段采用随机森林分析建立临床判别模型，在测试阶段采用交叉验证。为了验证外泌体SORL1区分CRC患者和HC的能力，研究人员随机选取了27例CRC患者和25例HC患者作为训练集，其余样本在测试集中进行表征。结果显示，与健康人相比，SORL1在CRC患者样本中显著上调（图5B）。91.14%的CRC患者（79人中有72人）和100%的HCs被正确诊断（图5C），同时具有达到0.99的工作特征曲线下面积（AUC）（图5D）。同时，研究人员也考察了外泌体SORL1在其他几个特定人群。他们检测了该方法对80例早期CRC患者（期和Ⅱ期）的诊断性能。结果表明，早期CRC患者和HCs的样本可以被有效区分（图5E），其诊断灵敏度达到97.50%，AUC为0.99（图5F、5G），具有较好的诊断准确性。

目前对于50岁以下的低中危人群的CRC筛查尚未达成（young CRC patients，yCRC)。在yCRC人群中，该方法的结果清楚地揭示了外泌体SORL1可以区分yCRC患者和HCs，诊断敏感性和特异性均达到100%（图5H）。但对于yCRC的诊断结果可能需要进一步的研究，因为该研究仅有12例yCRC患者。在该研究中，研究人员同时增加了35个肿瘤样本，包括12个胃癌（gastric cancer，GC）、12个肺癌（lung cancer，LC）和11个胰腺癌（pancreatic cancer，PANC）样本，以验证SORL1是否在CRC中特异性表达。利用上述35例肿瘤样本，随机选取35例健康对照者，共形成70例样本，构成非CRC对照组。结果表明，SORL1可以从非CRC癌症患者中诊断CRC患者，灵敏度和特异度分别达到93.67%和96.15%（图5I）。

图5 基于AI分类的外泌体SORL1的诊断性能

单一标志物CEA检测常用于血液学CRC筛查。结果显示，CEA的诊断敏感性为47.17%，在106例CRC患者中仅有50例被正确诊断（图6A、6B）。而超过一半的早期CRC病例CEA阴性，表明其在早期CRC患者中的诊断能力较差。进一步研究发现，在56例CEA阴性患者中，52例患者被本研究提出的方法正确诊断（图6C），诊断AUC为0.99（图6D）。

该研究的方法的潜在应用在两个病例中得到了肯定，这两个病例通过该研究发展的方法得以正确诊断，而其被CEA、上皮细胞粘附分子（EpCAM）和结肠镜检查遗漏了（图6E）。一号病人因排便不规律而入院。结肠镜检查显示无明显恶性特征，诊断为良性息肉（图6F）。然而，术后病理报告证实了高级别上皮内瘤变（图6F）。第二例患者也出现了类似的情况，该患者使用基于SORL1的微流控芯片方法诊断为CRC，病理证实为原位I期CRC，但CEA和EpCAM未发现（图6E、6F）。这些结果有力地证明了外泌体SORL1在检测微小肿瘤和早期CRC方面的优势。

图6 通过SORL1等方法诊断CRC

综上所述，该研究通过在微流控芯片上构建3D多孔海绵结构，将其与新发现的CRC分子标记物SORL1、量子点检测方法和机器学习智能分析系统相结合，建立了一种新型特异高效的检测技术平台。该平台能够实现外泌体在芯片表面的高度富集，便于快速捕获和定量检测。新建立的智能图像判别系统能够高效地实现CRC的早期诊断，为CRC的早期检测提供了新方法和新途径。

审核编辑：刘清