活细胞的“聚光灯”——前沿活细胞成像的案例分享

细胞是一切生命的基本单位，构成了各式各样的生命体。因此研究细胞的结构以及内部生命活动过程可以帮助我们更深入地探究生命的奥秘，了解生命体是如何构建和运作的。传统的细胞显微术只能通过观察固定的细胞标本进行推测，但已经失“活”的细胞已经无法反应新陈代谢、信号传导等生命活动，无法反应活细胞的真实情况。因此活细胞显微术越来越受到生命科学研究学者的青睐，能够在细胞仍然活跃并处于正常生理活动的状态下进行观察，帮助科学家更好地研究细胞间的相互作用，以及进行药物研发和筛选等方面的应用。在这里，我们整理了近几年来自Lumencor的白光光源运用于活细胞显微术的前沿研究，希望能为您的研究带来灵感。

细胞内部Ca2+，线粒体膜电位和细胞质乳酸的延时成像

来自威斯康星大学麦迪逊分校Sophia M. Sdao, Thuong Ho, Chetan Poudel等科学家研究了CDK2和β活细胞之间的关系，发现CDK2可以抑制β活细胞的氧化糖代谢和胰岛素分泌，同时对β细胞的代谢信号和K(ATP)通道有重要影响。作者利用一个可诱导的β细胞特异性CDK2缺失的小鼠模型(CDK2-IKO)进行研究，发现这种小鼠的葡萄糖耐受性和葡萄糖刺激的胰岛素分泌都有所提高。实验中通过多种方法测量了CDK2-IKO小鼠的β细胞电活性、钙信号、NAD(P)H荧光寿命、乳酸水平和线粒体膜电位。在搭建延时成像生物传感器时，采用Lumencor SOLA SEII 365作为荧光激发光源，并且基于Lumencor精确的电子控制系统，可以快速调节光输出的强度，设置以<20%的功率进行输出。

参考文献

Sdao S M , Ho T , Poudel C ,et al.CDK2 limits the highly energetic secretory program of mature β cells by restricting PEP cycle-dependent KATP channel closure[J].Cell Reports, 2021, 34(4)10.1016/j.celrep.2021.108690.

HuH-7人肝癌细胞中GFP表达的20小时延时成像

非病毒基因递送是基因治疗领域的一个快速发展的研究课题，其低免疫原性避免了免疫系统对外源基因的排斥和攻击，提高了基因治疗的安全性和有效性，但这受到合成核酸纳米载体在内吞体内停留时间的限制。为了克服这种瓶颈，需要一种能够同时测量纳米载体的摄取动力学和转染效率的方法。慕尼黑大学的研究人员A. Reiser, D. Woschée, N. Mehrotra等人使用单细胞阵列的活细胞成像(LISCA)来研究不同血清条件下基于脂质mRNA复合物的递送时间分布，文中使用HuH-7肝癌细胞作为系统模型（RNA治疗的主要靶器官之一）。该方法可以同时监测数百个单细胞的eGFP报告基因表达，通过拟合到模型，即可得到每个单细胞的表达起始时间和表达速率等参数。本文采用微结构单细胞阵列和自动活细胞延时显微镜来收集单个荧光时间过程。其中用于延时成像的时间分辨荧光显微镜搭载的即是来自Lumencor的SOLA-SE II LED光源。

参考文献

Reiser A ,D Woschée, Mehrotra N ,et al.Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection[J].Integrative Biology, 2019, 11(9).DOI:10.1093/intbio/zyz030.

高通量多色荧光显微镜观察单个大肠杆菌细胞双链断裂修复

来自瑞典乌普萨拉大学和皇家理工学院的研究人员Wiktor J, Gynnå A H, Leroy P等在Nature上发表了一篇探索活细菌中RecA螺旋丝如何通过同源重组修复双链DNA断裂（DSB）机制的文章。在一个可诱导的DSB系统中，利用高通量、微流控和荧光显微技术，直接观察大肠杆菌中DSB修复的过程，以及RecA蛋白在修复中的动态变化，如下图中所展示的。

在搭建实验所用的荧光显微镜时，Lumencor的Spectra III 系列的荧光光源与Nikon的Ti2-E倒置显微镜以及Andor的Sona 4.2B-11 sCMOS相机组合使用。显微镜由运行内建插件Micro-Manager控制。而荧光光源由相机通过TTL连接触发，使用电子快门控制。Lumencor的TTL触发输入可以外部控制集成的八个光源的选择以及开关，凭借精确的电子控制，切换速度间隔可达10μs。

参考文献

Wiktor J, Gynnå A H, Leroy P, et al. RecA finds homologous DNA by reduced dimensionality search[J]. Nature, 2021, 597(7876): 426-429.

基因编码电压指示剂 （GEVI） JEDI-1P 在解离的大鼠皮质和海马神经元中的成像

使用基因编码的电压指示剂（GEVI）进行宽场成像是了解大型皮层网络在神经编码行为中的作用的一种有前景的方法。莱斯大学以及埃默里大学的研究人员开发了一种针对单光子成像优化的GEVI和改进的方法，应用于小鼠长期的全脑电压成像。并通过一个自动化高通量筛选平台，使其具有快速的动力学、高亮度、高灵敏度和在宽常单光子照明下的高光稳定性。在多轮定向进化后，产生了在所有指标上都有所提高的JEDI-1P，这是一种绿色的荧光指示剂，最终研究人员成功在清醒小鼠中实现了稳定的全脑电压成像。

为了以高通量的方式评估GEVI的性能，研究人员搭建了一个基于倒置显微镜（A1R-MP,Nikon Instruments）自动化多模式的96孔筛选平台。由Lumencor的LED光引擎（SpectraX）产生激发光，通过液态光波导（LLG）引导至显微镜的荧光顶置照明器。其中青色光(中心波长/带宽，470/24nm)和绿光(550/15nm)通过物镜分别照射到样品台上，激发基于GFP的GEVI以及mCherry。

参考文献

Lu X, Wang Y, Liu Z, et al. Widefield imaging of rapid pan-cortical voltage dynamics with an indicator evolved for one-photon microscopy[J]. Nature Communications, 2023, 14(1): 6423.

Fura-2 Ca2+在小鼠垂体细胞中的成像

为了探究蛋白酪氨酸磷酸酶受体N和N2（PTPRN和PTPRN2）在小鼠繁殖过程中的性别特异性作用机制，美国国立卫生研究院的尤尼斯肯尼迪施莱佛国家儿童健康与人类发展研究所 (Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development)的研究人员对PTPRN和PTPRN2进行双敲除（DKO），结果导致雌性小鼠不育，表现出青春期延迟、无排卵、卵巢基因表达和类固醇合成的改变。而雄性小鼠则大部分育性不受影响，睾丸的基因表达、类固醇合成以及生殖器官的发育没有明显影响。在研究过程中，钙离子成像技术被用于研究垂体细胞的成像，研究PTPRN和PTPRN2的缺失对垂体促性腺激素细胞（gonadotrophs GnRH）的钙信号的影响。钙离子荧光探针Fura-2 AM 所对应的340/30nm和380/20 nm激发带通由Retra II光引擎（Lumencor,Beaverton,OR）提供，激发带通通过510/84nm的滤光片进行了检测。

图中展示了一些GnRH（100pM）诱导培养垂体细胞中的钙信号数据。实验使用源自WT和DKO雄性和雌性小鼠的细胞进行。

参考文献

Sokanovic S J , Constantin S , Dams A L ,et al.Common and female-specific roles of protein tyrosine phosphatase receptors N and N2 in mice reproduction[J].Scientific Reports[2024-01-15].DOI:10.1038/s41598-023-27497-4.

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