荧光分光度计怎么使用?荧光分光光度计使用步骤

　　荧光分光光度计概要

　　荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数，从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的测定， 不但可以做一般的定量分析， 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化， 从而阐明分子结构与功能之间的关系。荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190~650nm，发射波长扫描范围是200~800nm。可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。

 

　　荧光分光光度计分类

　　荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便、工作曲线线形范围宽等优点，可以广泛应用于生命科学、医学、药学和药理学、有机和无机化学等领域。

　　荧光分光光度计的发展经历了手控式荧光分光光度计，自动记录式荧光分光光度计，计算机控制式荧光分光光度计。

　　光分光光度计三个阶段;荧光分光光度计还可分为单光束式荧光分光光度计和双光束式荧光分光光度计两大系列。其他的还有低温激光Sh p ol’skill荧光分光光度计，配有寿命和相分辩测定的荧光分光光度计等。

 

　　荧光分光光度计操作步骤

　　1.开机：接通电源，打开主机开关，点燃（打开）光源后，根据说明书要求启动计算机。

　　2.检测前准备：参照仪器说明书，在20天内至少进行一次激发校准和发射校准，检测前仪器应预热。

　　3.工作条件的选择：环境温度应在20℃±5℃;相对湿度不大于70%;电源稳定，无磁场、电场干扰。根据样品的特性及荧光强度，选择合适的仪器工作条件（如狭缝、PM增益、响应时间等）。

　　4.基本测定

　　（1）荧光激发光谱测定

　　设置仪器参数，扫描发射波长，找到maxλem，以此为发射波长，记录发射强度作为激发波长的函数，便得到激发光谱。

　　（2）荧光发射光谱测定

　　设置仪器参数，扫描激发波长，找到maxλex，以此为激发波长，记录发射强度与发射波长间的函数关系，便得到荧光发射光谱。

　　（3）差谱测定

　　设置仪器参数，选择合适的工作方式，测定背景溶液的发射光谱并储存起来，在一定的工作方式下，扫描样品溶液的发射波长，得到当时的光度值和储存的背景值之间的差示值，即差谱。

　　（4）峰面积积分

　　选择适当的工作方式，对样品溶液进行积分操作，即得到峰面积积分。

　　（5）荧光强度

　　选择合适的测量参数，设置λex、λem，采用定点读数或扫描方式，即可测得所选波长处的荧光强度。

　　（6）定量测定

　　配制一系列已知浓度的标准溶液，在一定的测定条件下，设置λex、λem，按照由稀至浓的次序，测定标准溶液的荧光强度，绘制荧光强度—浓度的工作曲线，不改变仪器参数测定未知溶液的荧光强度，由工作曲线即可求出未知溶液的浓度。

　　F-2700荧光分光光度计详细操作规程

　　1、开机

　　（1）开启计算机

　　（2）开启仪器主机电源按下仪器主机左侧面板下方的黑色按钮（POWER）同时，观察主机正面面板右侧的Xe LAMP 和RUN指示灯依次亮起来，都显示绿色为正常。

　　（3）双击桌面图标（FL Solutions 4.1 for F-7000），主机自行初始化，扫描界面自动进入

　　（4）初始化结束后，须预热15-20分钟，出现操作主界面（界面右下角出现Ready）

　　2、点击扫描界面右侧“Method”

　　在“General”选项中的“Measurement”选择“wavelength scan”测量模式 在“Instrument”选项中设置仪器参数和扫描参数 选择扫描模式“Scan Mode”：Emission/Excitation（发射光谱/激发光谱） 选择数据模式“Data Mode”：Fluorescence （荧光测量） 设定波长扫描范围

　　扫描荧光激发光谱（Excitation）：需设定激发光的起始/终止波长（EX Start/End WL）和荧光发射波长（EM WL）

　　扫描荧光发射光谱（Emission）：需设定发射光的起始/终止波长（EM Start/End WL）和荧光激发波长（EX WL）

　　其他选项可选择默认值（也可根据具体实验要求自行设定） 参数设置好后，点击“确定”

　　3、设置文件存储路径（此步也可不进行参数设置，可以在按5中方法进行保存）

　　（1）点击扫描界面右侧“Sample”

　　（2）样品名可自行命名

　　（3）选中“Auto File”，可以自动保存原始文件和TXT格式文本文档数据

　　（4）参数设置好后，点击“OK”

　　4、扫描测试

　　（1）打开盖子，放入待测样品后，盖上盖子（请勿用力）

　　（2）点击扫描界面右侧“Measure”，窗口在线出现扫描谱图

　　5、数据处理与保存

　　（1）选中自动弹出的数据窗口

　　（2）右键--“Trace”，进行读数并寻峰等操作

　　（3）“File”--“Save as”对数据进行保存

　　6、关机顺序：

　　（1）关闭运行软件FL Solution 2.1 for F-7000

　　（2）选中“Close the lamp，then close the monitor windows？”点击“Yes”窗口自动关闭同时，观察主机正面面板右侧的Xe LAMP指示灯暗下来，而RUN指示灯仍显示绿色

　　（3）约十分钟后，关闭仪器主机电源，即按下仪器主机左侧面板下方的黑色按钮（POWER）（目的是仅让风扇工作，使Xe灯室散热）

　　（4）从样品池中取出所有比色皿，清洗干净以便下一次使用

　　（5）关闭计算机

 

　　荧光分光光度计使用注意事项

　　1.在实验开始前，应提前打开仪器预热，并配制好所需的溶液，对于已经配制好的溶液，在不用时放在4℃冰箱中保存，放置时间超过一星期的溶液要重新配制。

　　2.实验所用的样品池是四面透光的石英池，拿取的时候用手指掐住池体的上角部，不能接触到四个面，清洗样品池后应用擦镜纸对其四个面进行轻轻擦拭。

　　3.在测试样品时，注意荧光强度范围的设定不要太高，以免测得的荧光强度超过仪器的测定上限。

　　4.实验结束后，要及时的清理台面，处理废液，清洗和放置好样品池，将下次要用的溶液放回冰箱，并且按规定登记实验记录，养成良好的实验习惯。