用于光学显微镜的新型波长选择器技术

许多光学显微镜应用，特别是涉及荧光成像的应用，需要波长辨别，要么过滤宽带照明源，要么过滤到达相机的图像，或者两者兼而有之。用于波长过滤的传统工具，如AOTF单色仪和滤光轮，都有不同程度的限制，这通常会影响它们在显微镜中的使用。

虹科柔性波长选择器（FWS）是一种新型波长滤波设备，为照明和图像滤波提供了优势的组合。具体地说，虹科FWS器件将单色器的波长可调谐性和带宽控制与滤光轮的圆形均匀孔径相结合，这些设备具有紧凑、操作简单和明显成本效益的优点。在这篇文章中，我们描述了这项新的专利技术，并讨论了它在显微镜方面的优势。

图像滤波与光谱成像

荧光探针的标测是基于波长选择性成像，源波长与目标荧光团的吸收峰匹配以获得最佳激发。在同一实验中使用多个荧光团的情况下，使用两个不同的波长可以选择性地激发每个荧光团。以这种方式，可以在包括来自激发源的散射和其他波长的荧光的背景下以最大信噪比选择性地观察来自每个荧光团的斯托克斯位移荧光。

波长选择性和可调谐性在其他类型的光学显微镜中也是有用的，例如用于对没有内源性荧光或添加荧光团的透明样品成像的相位对比度和倾斜照明方法。这里众所周知，迭代地改变（调整）照明条件，特别是波长，可以选择性地优化图像场内不同目标的对比度。

不同滤波技术的限制

（1）滤波器

在显微镜的检测部分，滤光片和二向色分束器是在相机或目镜之前进行波长滤波的常用手段。这些滤波器可以与宽带光源一起使用，用于波长选择性照明，而不是LED或激光器。滤波器通常基于薄膜电介质，有时结合彩色玻璃用于额外的波长阻挡。对于单个荧光团，通常在相机之前使用带通或截止滤波器。对于两个或多个荧光团，可以使用二向色电介质分束器根据波长将光分成两个相机，或者荧光团可以使用单个相机前面的滤光轮交替成像。

滤波器和滤波器轮的局限性在于它们缺乏灵活性，因为每个滤波器的带通波长和中心波长是固定的。因此，图像不能作为波长的函数进行扫描，也不能迭代地调整波长和带宽以找到特定样本的最佳（例如，高对比度）观看条件。

（2）单色仪

单色仪基于衍射光栅或色散棱镜对光源输出进行选择。为了过滤光源，输出狭缝或光纤仅用于选择目标波长窗口，通过旋转光栅（或棱镜）角度来连续地调谐该频带的中心。通过调节输入和输出狭缝的宽度，也可以平滑地改变透射光的带宽。然而，在图像检测过程中并不常用单色器。原因是相机阵列的只有一个轴可以用于成像，另一个轴用于波长色散。因此，图像必须单行或单像素进行构建。

（3）声光可调谐滤波器（AOTF）

AOTF是基于将射频（RF）输入施加到诸如二氧化碲（TeO2）之类的奇异晶体的固态组件，由此产生的声学振动起到移动衍射光栅的作用。AOTF的主要优点是切换时间快，可以同时控制多个输出。然而，它是一个复杂的射频供电系统，成本相对较高。AOTF也具有较差的带外消光。

虹科FWS-新型滤波技术

虹科FWS将其中两个宽带带通滤波器组合在一个紧凑、不透光的外壳中。这种设计使得每个滤波器的入射角能够独立旋转。虹科FWS提供了具有滤波器的大净孔径的单色仪的波长灵活性和精度，高带外消光以及几乎不受温度或湿度变化影响的性能。此外，它简单、经济、坚固，可以作为显微镜的小型设备进行封装。

虹科FWS产品的带宽可以从大约1.5纳米调整到20纳米（标称），并且，中心波长可以从大多数可见波长（350 nm–900 nm）中选择。由于它们需要准直光，显微镜中的无限空间（即，在相机之前）是基于该技术的紧凑型设备的理想位置。此外，准直输入/输出允许简单的光纤耦合，简化集成。这些特性使其成为相机和显微镜光源中光谱滤波的理想选择。

虹科波长选择器的TwinFilm专利技术

如下图所示，可以将虹科FWS用于激发和发射。对于激发，有必要选择最佳波长以获得最大效率，并避免多荧光团实验中的交叉激发。对于发射，可以扫描整个波长范围以进行光谱成像。

对于多重标记的多色荧光成像非常有用。在用不同的荧光团标记细胞的不同部分后，可以使用虹科波长选择器进行同时成像。下图显示了分别标记有DAPI（细胞核）、CMFDA绿（胞浆）和线粒体深红色FM（线粒体）的固定HeLa细胞的荧光图像。无需三种滤波器组或单色仪耗时扫描，可使用虹科FWS多边形同时进行三色成像。

使用不同染色剂标定的HeLa细胞的荧光图像

虹科波长选择器的优异性能，使其具有广泛的应用范围和巨大的市场前景，可代替单色仪、AOTF等用于荧光显微镜、高光谱成像、生命科学仪器、机器视觉、实验室研究、光源检测、高光谱成像等多个领域。

审核编辑 黄宇